杂志名称：Cell

文献题目：CD10+GPR77+ Cancer-Associated FibroblastsPromote Cancer Formation and Chemoresistance by Sustaining Cancer Stemness

第一作者：ErweiSong

作者单位：Guangdong Provincial Key Laboratory of Malignant Tumor Epigenetics and Gene Regulation, Medical Research Center, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, China

本实验所用产品：RayBiotech人AAH-CYT-5抗体芯片（80个细胞因子抗体芯片）

实验样品：胸腺癌患者肿瘤组织

研究背景：

肿瘤干细胞（CSCs）是对肿瘤形成和肿瘤耐药性起到重要作用的细胞群，但未有对其的标记物。肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）是许多恶性肿瘤（如胸腺癌/肺癌等）共有的癌细胞，许多研究表明CAFs在肿瘤形成和恶化过程中对肿瘤干细胞（CSCs）有影响，但由于CAFs有许多不同的亚群，各自分泌不同的细胞因子，无法判断出是哪一类CAF作用于CSCs。本文旨在探究是哪一类CAFs亚群分泌了哪些蛋白分子影响CSCs，使其对化疗药物产生抗性，促使癌症发展。

1 结果

1.1 验证在胸腺癌和肺癌患者中发现的一种高表达CD10和GPR77的CAF细胞亚群与肿瘤耐药性和低存活的相关性

    为了探究是哪一种CAFs亚群影响肿瘤耐药性和低存活，收集了578位化疗前后的胸腺癌患者的组织样品，分离出CAF同癌细胞共培养，发现耐药性癌组织中CAF对癌细胞有影响。采用mRNA芯片检测mRNA表达量，发现CD10和GPR77基因表达量上调，流式免疫荧光染色，表明CD10和GPR77蛋白在耐药性肿瘤组织CAF中的表达。

1.2 验证CD10+GPR77+CAF诱导癌细胞耐受和自身耐受

    为探究高表达CD10和GPR77的CAF亚群是否通过诱导细胞耐受影响癌细胞，收集CD10+GPR77+ CAF，同抑制药物处理的癌细胞共培养，发现CD10+GPR77+ CAF有效维持了癌细胞系和原代癌细胞的存活。

    为更明显的说明诱导效果，注射癌细胞到免疫功能不全的小鼠乳腺中，建立移植瘤小鼠模型。发现CD10+GPR77+ CAF不止自身抵抗化疗，还能诱导肿瘤细胞在其CAF微环境影响下耐受。

1.3 验证CD10+GPR77+CAF组成CSCs 的Supporting Niche（微环境）

    由于在胸腺癌耐药性样本中发现ALDH1+ CSCs的比例升高，进行临床胸腺癌CSCs和CD10+GPR77 CAF的相关性实验，在ALDH1+CSCs中发现CD10+GPR77+ CAF，建立派生瘤模型（PDX），进一步探究在移植瘤模型中CD10+GPR77+CAF是否有助于肿瘤形成的能力，发现了胸腺癌基质中的CD10+GPR77+CAFs有助于PDX的建模和通过CSC增殖形成肿瘤的能力。

1.4 验证CD10+GPR77+CAFs通过分泌白介6（IL6）和白介素8（IL8）诱导CSCs增殖

        为探究CD10+GPR77+ CAFs的作用机制，使用人类蛋白抗体芯片检测了CD10+GPR77+CAFs分泌的蛋白因子，通过蛋白板检测CD10+GPR77+CAFs分泌蛋白，发现了IL-6 和 IL-8蛋白量在CD10+GPR77+CAF明显增多，说明CD10+GPR77+ CAF通过分泌IL-6 和 IL-8，促进CSC增殖和肿瘤派生转移，诱导肿瘤耐受性，分别进行沉默IL-8基因和IL6基因，发现CD10+GPR77+CAFs产生IL-8，IL-8依赖于IL6调控。

1.5 验证通过P300调控P65乙酰化延迟NF-kB激活，以维持CD10+GPR77+CAFs的表型和功能

        为解释CD10+GPR77+CAFs持续产生IL6和IL8激活信号通路的机制，进行了富集分析GSEA（gene set enrichment analysis）、WB（Western Blotting）发现在CAFs中，通过p65磷酸化（S536）和乙酰化（K310）维持 NF-kB的活化，同时也需要其他分子信号（如IKK活化）参与。免疫沉淀反应发现p65与p300的相互作用影响其在K310的乙酰化。

1.6 验证在CD10+GPR77+CAFs中，GPR77诱导P65磷酸化是p65乙酰化和参与NF-kB活化的前提

        进一步探究CD10和GPR77 蛋白是否在CD10+GPR77+CAFs中参与信号通路和维持细胞功能。敲除GPR77基因，发现IL6和IL8分泌明显减少，NF-kB活化受到抑制，p65蛋白减少。沉默GPR77完全抑制RSK1的表达，对IKK没有明显影响。说明GPR77诱导P65磷酸化是p65乙酰化和参与NF-kB活化的前提。在MCF-7共培养胸腺癌细胞中，沉默GPR77可终止CD10+GPR77+ CAFs促进CSC增殖和耐药性的能力。由于GPR77是C5a补体的受体，进一步探究CAF自身是否产生维持GPR77信号表达的补体。发现在CD10+GPR77+CAFs产生较多C5a补体。（6J/6K）且NF-kB调控C5a产生。

1.7 抗GPR77肿瘤抑制剂和提高化疗效果治疗胸腺癌派生瘤模型